表面抗原密度
细胞携带的抗原或靶分子的数量与阳性群的强度直接相关, 并将决定与其匹配的最佳荧光素。
将荧光强度低的荧光素与高表达抗原配对, 将荧光强度强高的荧光素与低丰度抗原配对, 可以提高细胞群体的分辨率, 但是如何得知抗原密度呢？
本指南列出了一些常见的人和小鼠细胞表面标记物的抗原密度, 以帮助您选择正确的荧光素。另外提供了如何使用抗体结合珠测量抗原密度的方法。
常见人标记物的抗原密度
新鲜分离的外周血细胞表面发现的常见标记物的抗原密度。
图 1.21 种常见人类标记的数据。获得每个表面标记物的几何平均荧光强度，并将其转换为抗原密度, 并以对数刻度绘制。图中结果来自于正常人外周血的 4 次独立实验结果。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据并在 FlowJo 中进行结果分析。
荧光素亮度
本示例说明了 CD4 与更亮荧光素（PE）配对可以提高分辨率。
图 2. 荧光素的相对亮度。外周血 CD4 染色的示例显示了 3 种荧光团从暗（Pacific Blue）到亮（PE）的相对亮度。显示的数据是在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获得的。
常见小鼠标记物的抗原密度
C57BL/6 小鼠的新鲜分离的脾脏细胞表面的常见标记物的抗原密度。
图 3.16 种常见小鼠标记物的数据。获得每个表面标记物的几何平均荧光强度, 并将其转换为抗原密度, 并以对数刻度绘制。图中数据来自于 C57Bl/6 小鼠的 3 次独立实验的结果。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据并在 FlowJo 中进行结果分析。
荧光素配对
为了获得最佳结果, 应将低密度抗原与明亮的荧光素配对, 将高密度抗原与较暗的荧光素配对。
图 4. 染色示例。 A, 人外周血单核细胞用 CD14 A700 和 CD163 A488 染色。B, 小鼠骨髓细胞用CD11b PB 和 GR-1 FITC 染色。在 Bio-Rad ZE5 流式细胞分析仪上获取数据。
| 星光染料分类 | 已上市和待上市染料 |
| StarBright Blue （488 nm） | SBB510,SBB575, SBB610,SBB670, SBB700,SBB750, SBB780 |
| StarBright Violet （405 nm） | SBV440,SBV475, SBV515,SBV570, SBV610,SBV670, SBV710,SBV760, SBV790 |
StarBright UV （355 nm） | SBUV400,SBUV445, SBUV510,SBUV575, SBUV605,SBUV665, SBUV750,SBUV795 |
全新流式染料星光系列：更亮的亮度, 更窄的发射波普, 缓冲液兼容性好, 染色一致性好（具体见上表）。
四个简单步骤测量抗原密度
Quantum 系列校准微球有 FITC 和 PE 两种荧光标记可选根据对应的检测抗体的荧光素来选择, 微球大小近似于人类淋巴细胞, 中级强度的试剂盒可以很好地涵盖典型细胞样品的范围。结合标准曲线, 可以计算待检测抗原的密度。该种方法也可用于确定流式细胞仪线性度。
1、滴定抗体
通过合适的抗体浓度找到最佳的染色指数。
2、微球染色
确保微球的量是饱和的。珠子的荧光强度随着抗体结合能力 ( ABC ) 而增强。
3、创建标准曲线
使用半高/全宽门测量几何平均值, 创建针对抗体结合能力的荧光标准曲线。
4、测量抗原密度
使用阳性群体的几何平均荧光强度, 可以计算感兴趣细胞上任何抗原的密度。
Bio-Rad 于 2013 年 1 月收购了知名抗体公司 AbD Serotec。该公司成立于 1982 年, 总部位于英国牛津。提供上万种抗体和免疫学试剂、单抗制备和多种规模的抗体生产和标记服务。其宗旨为生产高质量的抗体和免疫学试剂。该公司拥有最具特色的大鼠 CD68 单抗（克隆号: ED1）; 抑制素 A 检测试剂盒为专利产品; 将 SpyTag 技术引入 HuCAL 平台, 提供非动物来源的抗体定制服务。
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